Diseño y validación in silico de primers dirigidos contra las regiones 18s y PFK para el estudio metagenómico de trypanosoma spp.

Abstract

La Tripanosomosis es una enfermedad desatendida que genera pérdidas económicas en zonas tropicales del mundo y limita la productividad pecuaria de varios países en vías de desarrollo. La secuenciación de nueva generación (NGS) se ha convertido en una herramienta estándar para muchas aplicaciones, entre las cuales destaca su capacidad para detectar múltiples especies de agentes infecciosos, procedentes de una gran cantidad de muestras. Bajo este contexto, Ecuador tiene pocos estudios moleculares sobre tripanosomosis y ninguno estudia esta enfermedad bajo el enfoque metagenómico de lecturas largas (>800 pb). A pesar de este escenario, y debido a la falta de marcadores moleculares universales para detectar varias especies de tripanosomas, se hace necesario el diseño de primers orientados a regiones génicas informativas, para su empleo en los flujos de trabajo destinados a una secuenciación NGS de lecturas largas. Es por ello que en el presente estudio se diseñaron primers degenerados dirigidos a las regiones de los genes 18S y fosfofructocinasa (PFK) para el estudio metagenómico de Trypanosoma spp. Para cumplir este objetivo, se realizó la búsqueda de genes de interés mediante el análisis de secuencias de genomas de referencia de T. vivax, T. theileri, T. equiperdum y T. evansi., extraídas de la base de datos especializada Tryp-DB y se recuperaron secuencias adicionales de la base de datos de GenBank, a través de un BLASTnt, seguido de un alineamiento de secuencias a través del programa Clustal-Omega. Una vez alineadas las secuencias, se diseñaron primers orientados a regiones conservadas, incluyendo nucleótidos degenerados y seleccionado solo aquellos que permitieran la amplificación de amplicones de gran tamaño. Adicionalmente, la validación in silico de los primers diseñados se efectuó mediante un BLAST de nucleótidos. Se hallaron numerosas secuencias para el gen 18S de varias regiones geográficas y hospedadores, mientras que para el gen PFK se observó una disponibilidad limitada de secuencias en la base de datos GenBank. Mediante los alineamientos, se logró el diseñó de 4 sets de primers degenerados para cada gen para la amplificación selectiva de las áreas identificadas en los genes 18S y PFK de diferentes Trypanosoma spp. En el caso concreto de los sets para la amplificación del 18S, se lograron generar oligos con temperaturas de fusión (Tm) cercanas a los 60°C y productos esperados alrededor de las 1800 pb. Sin embargo, no se realizó la validación para el gen PFK dada la cantidad limitada de secuencias dentro del GenBank. Los primers diseñados para la región 18S presentan el potencial de generar amplicones largos, ideales para su uso en la preparación de librerías mediante reacción en cadena de la polimerasa (PCR), enfocadas en secuenciación de lecturas largas, como es el caso de la plataforma de Oxford Nanopore. Es necesaria la validación en el laboratorio de cada uno de estos sets de primers, empleando cepas o aislados de referencia, con la finalidad de comprobar analíticamente su desempeño y potencial en el trabajo de laboratorios de alta complejidad, orientados a la metagenómica de tripanosomátidos.