Diseño y validación in sílico de primers dirigidos contra GAPDH e ITS para el estudio metagenómico de Trypanosoma spp. mediante secuenciación de lecturas largas

Abstract

La Tripanosomosis es una enfermedad que provoca pérdidas económicas a nivel global y limita la productividad ganadera en varios países de la franja tropical. La secuenciación de próxima generación (NGS) se ha convertido en una herramienta estándar para diversas aplicaciones, destacando su capacidad para detectar múltiples especies de agentes infecciosos a partir de una amplia variedad de muestras. En este contexto, Ecuador cuenta con escasos estudios moleculares sobre la tripanosomosis, y ninguno aborda esta enfermedad desde la perspectiva metagenómica de lecturas largas (>800 pb). A pesar de esta situación, y ante la carencia de marcadores moleculares universales para detectar varias especies de tripanosomas, resulta esencial diseñar primers específicos dirigidos a regiones génicas informativas, para su implementación en flujos de trabajo destinados a la secuenciación NGS de lecturas largas. Por lo tanto, en este estudio se diseñaron primers degenerados dirigidos a las regiones de los genes Gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa (GAPDH) y el espaciador interno transcrito (ITS) con el objetivo de llevar a cabo un estudio metagenómico de Trypanosoma spp. Para lograrlo, se obtuvieron los genes de interés mediante el análisis de secuencias de genomas de referencia de T. vivax, T. theileri y T. evansi, obtenidas de la base de datos especializada Tryp-DB, y se complementaron con secuencias adicionales recuperadas de GenBank, mediante una búsqueda BLASTn. Estas secuencias se alinearon utilizando el programa Clustal-Omega. Una vez alineadas, se diseñaron primers orientados a regiones conservadas, incluyendo nucleótidos degenerados, y se seleccionaron aquellos que permitieran la amplificación de amplicones de gran tamaño. Además, se realizó una validación in silico de los primers diseñados mediante una analisis de identidad de nucleótidos usando BLAST. Se identificaron numerosas secuencias para los genes GAPDH e ITS de diversas regiones geográficas y hospedadores. Sin embargo, no fue posible diseñar primers para el gen ITS, debido a la considerable variabilidad entre las secuencias recuperadas de las bases de datos. En el caso específico de los sets de amplificación del GAPDH, se lograron generar oligos con temperaturas de fusión (Tm) cercanas a los 55°C y productos de alrededor de 800 pb. Los primers diseñados para esta región presentan el potencial de generar amplicones largos, ideales para su uso en la preparación de librerías mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR), especialmente enfocadas en secuenciación de lecturas largas, como es el caso de la plataforma de Oxford Nanopore. Es crucial realizar la validación en el laboratorio de cada uno de estos sets de primers utilizando cepas o aislados de referencia. Esto permitirá comprobar analíticamente su desempeño y potencial en laboratorios de alta complejidad, orientados a la metagenómica de tripanosomátidos.