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https://repositorio.uisek.edu.ec/handle/123456789/5643
Título : | Diseño de primers dirigidos a regiones del gen CYT - B para el estudio e identificación de Leishmania spp. |
Autor : | Gómes de la Rosa, Mathías Andrés Ramírez Iglesias, José Rubén |
Palabras clave : | BIOTECNOLOGÍA LEISHMANIA PRIMERS CITOCROMO B PCR |
Fecha de publicación : | jul-2025 |
Editorial : | Universidad Internacional SEK |
Citación : | UISEK-T BIO G529d/2025 |
Resumen : | La leishmaniasis, causada por protozoos del género Leishmania y transmitida por flebótomos, se manifiesta con formas cutánea, mucocutánea y visceral, con alta morbilidad y mortalidad en áreas endémicas. La detección molecular precisa de especies de Leishmania resulta compleja debido a la gran diversidad genética y a la inespecificidad de cebadores convencionales, especialmente en regiones con múltiples hospedadores reservorios y alta endemicidad como Ecuador. Por ello el objetivo de este trabajo fue diseñar primers dirigidos a la región del gen citocromo b (CYT-B) de Leishmania spp. mediante herramientas bioinformáticas. Se obtuvieron 35 secuencias de CYT-B de 10 especies de Leishmania (L. equatorensis, L. amazonensis, L. mexicana, L. tarentolae, L. braziliensis, L. guyanensis, L. naiffi, L. panamensis, L. peruviana y L. infantum) desde GenBank, filtradas por longitud (500–1100 pb), adecuadas para secuenciación Sanger. Las secuencias se alinearon con Clustal Omega usando parámetros predeterminados. Se identificaron regiones conservadas y espacios con variabilidad, cubiertos mediante el uso de bases degeneradas. Mediante revisión manual de alineamientos, se propusieron regiones de unión y se calcularon parámetros fisicoquímicos usando el servidor OligoCalc. De las 35 secuencias, la mayoría (82%) se agruparon como Neotrópico, 11% como Viejo Mundo y el resto dentro de “Leishmania” según origen geográfico, reflejando concordancia con estudios previos en Ecuador. Se obtuvieron dos sets principales: F1 (20 pb, 36 degenerancias) con R1 (19 pb, 55 degenerancias), y F2 (23 pb, 36 degenerancias) con R2 (20 pb, 40 degenerancias). Los rangos de Tm estimados fueron aproximadamente 33–54 °C. Los Tm bajos podrían comprometer la especificidad y eficiencia de amplificación, incrementando riesgo de amplificados inespecíficos o baja eficiencia 2 de secuenciación. La inclusión de elevados números de degenerancias amplía cobertura de especies, pero disminuye especificidad y puede inducir sesgos cuantitativos. Los cebadores diseñados mediante alineamiento de 35 secuencias de CYT-B permiten la detección amplia de Leishmania spp. en Ecuador, pero presentan valores de Tm y alta degeneración que pueden reducir especificidad y eficiencia. Se recomienda validar in vitro la funcionalidad de estos cebadores y considerar ampliaciones de alineamiento con más especies para optimizar futuros sets. Asimismo, explorar marcadores complementarios con menor degeneración puede mejorar precisión en estudios de diagnóstico molecular |
Descripción : | Leishmaniasis, caused by protozoa of the genus Leishmania and transmitted by sandflies, manifests in cutaneous, mucocutaneous, and visceral forms, with high morbidity and mortality in endemic areas. Accurate molecular detection of Leishmania species is complex due to the high genetic diversity and the non-specificity of conventional primers, especially in regions with multiple reservoir hosts and high endemicity such as Ecuador. Therefore, the objective of this work was to design primers targeting the cytochrome b (CYT-B) gene region of Leishmania spp. using bioinformatics tools. Thirty-five CYT-B sequences from 10 Leishmania species (L. equatorensis, L. amazonensis, L. mexicana, L. tarentolae, L. braziliensis, L. guyanensis, L. naiffi, L. panamensis, L. peruviana, and L. infantum) were obtained from GenBank and filtered by length (500–1100 bp) suitable for Sanger sequencing. Sequences were aligned with Clustal Omega using default parameters. Conserved regions and gaps in variability were identified and filled by using degenerate bases. By manual review of alignments, junctional regions were proposed, and physicochemical parameters were calculated using the OligoCalc server. Of the 35 sequences, the majority (82%) were grouped as Neotropical, 11% as Old World, and the remainder within “Leishmania” according to geographic origin, reflecting concordance with previous studies in Ecuador. Two main sets were obtained: F1 (20 bp, 36 degeneracies) with R1 (19 bp, 55 degeneracies), and F2 (23 bp, 36 degeneracies) with R2 (20 bp, 40 degeneracies). The estimated Tm ranges were approximately 33–54 °C. Low Tm could compromise amplification specificity and efficiency, increasing the risk of nonspecific amplifications or low sequencing efficiency. The inclusion of high numbers of degeneracies expands species coverage, but decreases specificity and can induce quantitative bias. Primers designed by alignment of 35 CYT-B sequences allow broad detection of Leishmania spp. in Ecuador, but their Tm values and high degeneracy can reduce 4 specificity and efficiency. It is recommended to validate the functionality of these primers in vitro and consider alignment extensions with more species to optimize future sets. Likewise, exploring complementary markers with less degeneration can improve the accuracy of molecular diagnostic studies. |
URI : | https://repositorio.uisek.edu.ec/handle/123456789/5643 |
Aparece en las colecciones: | Ingeniería en Biotecnología |
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