Diseño de primers dirigidos a regiones del gen CYT - B para el estudio e identificación de Leishmania spp.

Abstract

La leishmaniasis, causada por protozoos del género Leishmania y transmitida por flebótomos, se manifiesta con formas cutánea, mucocutánea y visceral, con alta morbilidad y mortalidad en áreas endémicas. La detección molecular precisa de especies de Leishmania resulta compleja debido a la gran diversidad genética y a la inespecificidad de cebadores convencionales, especialmente en regiones con múltiples hospedadores reservorios y alta endemicidad como Ecuador. Por ello el objetivo de este trabajo fue diseñar primers dirigidos a la región del gen citocromo b (CYT-B) de Leishmania spp. mediante herramientas bioinformáticas. Se obtuvieron 35 secuencias de CYT-B de 10 especies de Leishmania (L. equatorensis, L. amazonensis, L. mexicana, L. tarentolae, L. braziliensis, L. guyanensis, L. naiffi, L. panamensis, L. peruviana y L. infantum) desde GenBank, filtradas por longitud (500–1100 pb), adecuadas para secuenciación Sanger. Las secuencias se alinearon con Clustal Omega usando parámetros predeterminados. Se identificaron regiones conservadas y espacios con variabilidad, cubiertos mediante el uso de bases degeneradas. Mediante revisión manual de alineamientos, se propusieron regiones de unión y se calcularon parámetros fisicoquímicos usando el servidor OligoCalc. De las 35 secuencias, la mayoría (82%) se agruparon como Neotrópico, 11% como Viejo Mundo y el resto dentro de “Leishmania” según origen geográfico, reflejando concordancia con estudios previos en Ecuador. Se obtuvieron dos sets principales: F1 (20 pb, 36 degenerancias) con R1 (19 pb, 55 degenerancias), y F2 (23 pb, 36 degenerancias) con R2 (20 pb, 40 degenerancias). Los rangos de Tm estimados fueron aproximadamente 33–54 °C. Los Tm bajos podrían comprometer la especificidad y eficiencia de amplificación, incrementando riesgo de amplificados inespecíficos o baja eficiencia 2 de secuenciación. La inclusión de elevados números de degenerancias amplía cobertura de especies, pero disminuye especificidad y puede inducir sesgos cuantitativos. Los cebadores diseñados mediante alineamiento de 35 secuencias de CYT-B permiten la detección amplia de Leishmania spp. en Ecuador, pero presentan valores de Tm y alta degeneración que pueden reducir especificidad y eficiencia. Se recomienda validar in vitro la funcionalidad de estos cebadores y considerar ampliaciones de alineamiento con más especies para optimizar futuros sets. Asimismo, explorar marcadores complementarios con menor degeneración puede mejorar precisión en estudios de diagnóstico molecular